靶向編輯長壽基因 讓老弱血管“Q彈爽滑” 編輯FOXO3基因

據(jù)說人體內(nèi)的血管首尾相接長度可達(dá)10多萬公里，血液每天在其間奔跑，有的是“高速路”，有的是“國道”，有的又是“鄉(xiāng)間小路”。“新路”往往平滑順暢、暢通無阻，“老路”往往會坑坑洼洼、磕磕絆絆，有沒有可能通過生物技術(shù)的手段對“老路”進(jìn)行修補(bǔ)呢?

日前，《細(xì)胞干細(xì)胞》雜志在線發(fā)表了中國科學(xué)院生物物理研究所劉光慧研究組、北京大學(xué)湯富酬研究組和中國科學(xué)院動物研究所曲靜研究組的聯(lián)合研究成果——通過靶向編輯單個長壽基因獲得首例遺傳增強(qiáng)的人類血管細(xì)胞。

“我們在人胚胎干細(xì)胞中進(jìn)行基因編輯操作，對編輯后的干細(xì)胞進(jìn)行定向分化，可在實(shí)驗(yàn)室中獲得人類血管內(nèi)皮細(xì)胞(血管內(nèi)膜)、血管平滑肌細(xì)胞(血管中膜)及間質(zhì)細(xì)胞(血管外膜)。”論文通訊作者之一的中國科學(xué)院生物物理研究所研究員劉光慧介紹，遺傳增強(qiáng)的人類血管干細(xì)胞有望成為老弱血管“修補(bǔ)劑”，幫助修復(fù)衰老及受損血管，未來可能被應(yīng)用于心肌梗死、缺血性中風(fēng)等疾病的治療中。

腺病毒載體介導(dǎo) 選用“非主流”編輯器

提到基因編輯，CRISPR/Cas9技術(shù)名聲在外，它與ZFN、TALEN技術(shù)并稱為基因編輯“三大利器”。但此次選用的基因編輯技術(shù)卻并不是其中之一，而是被稱為輔助病毒依賴的腺病毒載體(HDAdV)介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)。

這個一口氣讀不下來的名字需要拆分來理解。腺病毒載體是這款“基因編輯器”有效的核心，它能被細(xì)胞“吞”進(jìn)去，并不會止步于細(xì)胞質(zhì)，卻能夠進(jìn)入到細(xì)胞核中，因?yàn)橐獙蜻M(jìn)行編輯、改寫、擦除等等操作，必須走進(jìn)基因的“大本營”細(xì)胞核中。

然而腺病毒載體會保持在染色體外，并不整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組中，這樣不會對人類基因組造成損傷。

“我們使用的是第三代腺病毒載體，缺失了腺病毒的基因組序列，因此大大降低了病毒載體的毒性。”劉光慧說，可以理解為，經(jīng)過技術(shù)改造，只保留了腺病毒“裝卸貨”的功能，而它的病毒特性已經(jīng)完全擯棄了。

當(dāng)“HDAdV腺病毒號”貨車攜帶的DNA同源重組序列進(jìn)入細(xì)胞核后，會自動完成基因組靶序列的搜索和置換工作。“HDAdV技術(shù)完全利用超大片段DNA同源重組的原理進(jìn)行基因編輯，一般不會造成如CRISPR/Cas9一樣的脫靶效應(yīng)。”劉光慧介紹，它可攜帶長達(dá)25—37kb的超長DNA片段進(jìn)入人類細(xì)胞核，置換基因組的固有片段，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)高效精準(zhǔn)的基因編輯。

技術(shù)越用越純熟，劉光慧研究組對HDAdV技術(shù)的應(yīng)用研究已經(jīng)積累多年。早在2011年，劉光慧等利用HDAdV基因編輯技術(shù)首次在人類疾病干細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了致病基因突變的高效精準(zhǔn)矯正。研究組研究生顏鵬澤接受采訪時表示，CRISPR/Cas9技術(shù)才剛剛問世、尚沒有在人類細(xì)胞中應(yīng)用時，實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)熟練利用HDAdV技術(shù)矯正或敲入了若干種人類致病基因突變。同時也多番證明HDAdV基因編輯技術(shù)的安全性，相關(guān)文章發(fā)表于《自然》《科學(xué)》《細(xì)胞》和《細(xì)胞干細(xì)胞》等雜志。2017年，研究組更是通過HDAdV技術(shù)產(chǎn)生了國際上首例遺傳增強(qiáng)的人類間充質(zhì)干細(xì)胞。

編輯FOXO3基因 它是長壽界“名門閨秀”

工欲善其事、必先利其器。有了趁手的技術(shù)和精巧的技藝，要使得血管細(xì)胞“年輕化”，應(yīng)該對哪段基因?qū)嵤┚庉嬆?

“FOXO3是最保守的、也是公認(rèn)的與長壽相關(guān)的基因。”劉光慧說，F(xiàn)OXO家族是一類轉(zhuǎn)錄因子，在上世紀(jì)90年代，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)FOXO家族同源蛋白可能參與了動物壽命的調(diào)控。

隨著研究的深入，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)FOXO3基因與人類長壽的確相關(guān)。更進(jìn)一步的研究精細(xì)到單個核苷酸。基本思路是，將百歲長壽老人群體的FOXO3基因與平均壽命78.5歲的老人對比，找到這個區(qū)域內(nèi)的核苷酸變異，逐步縮小與長壽直接相關(guān)的位點(diǎn)范圍。更進(jìn)一步的研究表明，許多國家地區(qū)的人在FOXO3基因中都能找到長壽相關(guān)的核苷酸變異。

研究組決定對FOXO3基因進(jìn)行編輯，還由于它能發(fā)揮“一石二鳥”的作用。干細(xì)胞應(yīng)用于人體其實(shí)有著很高的難度，猶如平衡“蹺蹺板”，干細(xì)胞的狀態(tài)必須恰到好處，如果太“瘋狂”可能成為腫瘤，如果太“弱小”有可能由于是外來細(xì)胞被機(jī)體消滅。

“研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO3具有維持血管穩(wěn)態(tài)的功能。”劉光慧說，它本身是一個轉(zhuǎn)錄因子，能激活下游的多個細(xì)胞保護(hù)的信號通路，F(xiàn)OXO3的活化還可通過誘導(dǎo)抑癌基因表達(dá)抵抗腫瘤形成，因此選擇FOXO3能同時提高細(xì)胞治療的效率和安全性。

為了證明這一點(diǎn)，研究組還將多種致癌因子導(dǎo)入了遺傳增強(qiáng)的血管細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)它也可以有效抵抗癌基因誘導(dǎo)的細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，這大大降低了利用這些細(xì)胞進(jìn)行治療的安全隱患，使得干細(xì)胞向臨床應(yīng)用邁向了堅實(shí)的一步。

是“節(jié)流”不是“開源” 調(diào)控細(xì)胞運(yùn)轉(zhuǎn)“管理層”

FOXO3基因編碼的FOXO3蛋白，實(shí)質(zhì)是一種轉(zhuǎn)錄因子。它的工作地點(diǎn)是細(xì)胞核內(nèi)，通過與基因的特定序列專一性結(jié)合，保證基因表達(dá)“有秩序”“有規(guī)律”。形象地說，它們是細(xì)胞生命運(yùn)轉(zhuǎn)中的“管理層”。

細(xì)胞內(nèi)部對“管理層”也有“彈劾”制度。在一定狀態(tài)下，比如細(xì)胞感到“吃飽喝足”了，就會通過PI3K/AKT通路磷酸化修飾FOXO3蛋白，讓這種蛋白打上磷酸化的“標(biāo)簽”，隨后這些FOXO3蛋白就被“奪權(quán)”了，活性被抑制，最終“下臺”被請出細(xì)胞核。

“了解了這樣的調(diào)控機(jī)制，我們選擇了‘節(jié)流’而不是‘開源’。”劉光慧說，為了對基因組改動最小，研究組并不增強(qiáng)FOXO3基因表達(dá)，而是通過2個堿基的置換保證FOXO3蛋白不被“彈劾”而且“連任”。

“我們使用HDAdV介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)置換了人胚胎干細(xì)胞中FOXO3基因的第3號外顯子中的兩個單核苷酸，使FOXO3蛋白轉(zhuǎn)錄因子不能有效地被AKT磷酸化，從而抑制了FOXO3蛋白的磷酸化和降解，促進(jìn)FOXO3在細(xì)胞核內(nèi)的聚集進(jìn)而激活下游‘有益’靶基因的表達(dá)。通過對人類基因組中的兩個核苷酸進(jìn)行精準(zhǔn)編輯，最大限度地保持了人類基因組的完整性。”劉光慧說。

經(jīng)過基因編輯的干細(xì)胞被定向分化為不同的遺傳增強(qiáng)型人類血管細(xì)胞后，進(jìn)行了相關(guān)動物實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)表明，小鼠腿部大動脈血管處被人為結(jié)扎后，向腿部輸送血液的道路就被封住了。把遺傳增強(qiáng)的血管細(xì)胞注射到腿部后，與注入未經(jīng)過遺傳增強(qiáng)的未經(jīng)基因編輯的血管細(xì)胞的對照組相比，前者有著更強(qiáng)的自我更新、抵抗氧化損傷及延緩細(xì)胞衰老等能力，可高效促進(jìn)受損血管再生，迅速恢復(fù)缺血部位血流。